磺胺类药物是对氨基苯磺酸的酰胺N-取代衍生物，因其抗菌谱广、价格低廉、性能稳定、疗效优良等特点，广泛应用于兽药中细菌和原虫感染的预防和治疗。但磺胺类药物在食物中的残留可能引起过敏反应、尿毒症和造血功能障碍。长期积累可能对损害肾功能、耐药性、致癌性等，对人体健康造成极大危害。为保证消费者的食品安全，欧盟委员会、美国食品药品监督管理局（FDA）和中国农业部都对食品中磺胺类药物的残留量规定了最高残留限量。

　　目前已提出了多种检测磺胺类药物的分析方法，如毛细管电泳、生物传感器技术、免疫分析以及高效液相色谱、气相色谱、液相色谱-串联质谱等。毛细管电泳对磺胺类药物表现出良好的分离能力，但存在精度低的问题。生物传感器技术具有良好的灵敏度，但容易出现假阳性。免疫测定不适合多残留和确证分析。气相色谱法相对困难，因为磺胺类药物极性高、挥发性低，分析前必须挥发。高效液相色谱-串联质谱法因其特异性强、灵敏度高，是分析磺胺类药物的有力技术。动物性食品的基质复杂，如果没有净化步骤或净化方法不当，很容易对目标物造成干扰，对仪器造成污染。目前已开发了一些分析方法来测定猪肉、鱼类等各种食品样品中的磺胺类物质，但大多数报道的方法采用离线固相萃取（SPE）、液-液萃取纯化或缺乏样品纯化步骤。离线SPE和液-液萃取纯化方法操作复杂，且纯化步骤耗时长、成本高。

　　本研究采用的在线SPE技术实现了样品预处理与仪器分析的结合，提高了样品分析的自动化程度，简化了预处理程序，提高了工作效率，避免了传统样品制备过程中的人为误差。目前，在线SPE技术在动物源性食品中磺胺类药物检测中的应用报道很少。现有的在线SPE技术检测磺胺类药物是与高效液相色谱相结合，但仅基于紫外检测器的方法由于灵敏度和特异性较低，并不是合适的确认方法。河北省食品检验研究院的Junmei Ma、Yan Zhang、Qiang Li等，在本研究中将在线SPE装置与液相色谱-串联质谱法相结合进行内标校正。通过优化在线SPE峰聚焦，实现了高效的纯化和分离。通过对回收率、线性、准确度和重复性的评价，该方法可用于监测磺胺类药物的非法使用。

　　为了验证合适的在线固相萃取程序，本研究对一些关键参数进行了评估。对于HLB滤芯，洗脱溶剂的极性越强，目标物越容易被洗脱，但同时也会洗出杂质。本研究以甲醇和乙腈为洗脱溶剂进行了比较，结果如图1所示，除磺胺异恶唑（SFZ）和磺胺甲基异恶唑（SMZ）外，甲醇的洗脱效果均优于乙腈。因此，本实验采用甲醇作为洗脱溶剂。

　　优化在线SPE的目的是为了获得最大的提取效率和样品净化。洗脱步骤的流速是需要优化的一个重要参数。在50 μL进样量和200 μL洗脱量的条件下，比较了100、150、200和250 μL/min的洗脱流速。根据15 种磺胺类药物（10 ng/mL）的反应和峰型，对洗脱效果进行了研究。洗脱流速的优化结果如图2所示。当洗脱流速为100 μL/min时，15 种化合物的峰型最佳，回收率最大；当洗脱流速继续增大时，洗脱不充分，部分化合物的峰面积较小，故选择洗脱流速为100 μL/min。

　　在50 μL注入样品量和100 μL/min洗脱流速的条件下，比较了50、100、150、200、250 μL的洗脱量。洗脱流速的优化结果如图3所示。结果表明，当洗脱体积为50 μL和100 μL时，目标化合物无法有效洗脱。随着洗脱体积的增大，目标化合物的峰面积逐渐增大。当洗脱体积达到200 μL时，目标化合物的峰面积变化趋于稳定，因此选择洗脱体积为200 μL。

　　本研究采用Symbiosis Pico自动在线SPE系统，该系统由在线SPE装置和液相色谱组成。经在线SPE纯化的样品直接注入LC柱进行分析，会造成目标物的洗脱液扩散，因此需要利用流动相稀释降低甲醇比例，使目标物峰集中在LC柱前端。本研究中，总流速固定为0.6 mL/min，初步流动相中有机物的比例固定为2%。洗脱流速为0.1 mL/min，为避免总流速变化引起的压力波动，造成异常峰，需降低流动相的速率（从0.6 mL/min降至0.5 mL/min）。

　　为使所有化合物达到最佳分离效果，研究了液相色谱条件的优化。采用不同的流动相体系，包括乙腈-水、乙腈-0.1%（V/V）甲酸水、甲醇-水，以及甲醇-0.1%（V/V）甲酸水。在ESI+的条件下，甲酸的加入可以提高化合物的电离度，从而提高分离效率和质谱信号的强度。甲醇和乙腈作为流动相对信号强度的影响不大。以甲醇为流动相进行梯度洗脱时，柱压变化较大，平衡时间较长。因此，选择乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相。

　　采用注射器注射将15 种磺胺类化合物和内标溶液（100 ng/mL）以5 μL/min的速率直接注入质谱仪。在Q1 MS全扫描中发现前体离子，利用产物离子扫描模式选择两个片段。采用多反应监测（MRM）模式监测前体到产物离子的转变。优化了产物的去簇电压（DP）和碰撞能（CE）。MRM采集模式下记录的化合物的提取离子色谱图如图4所示。

　　本研究基于在线SPE技术，建立了快速、灵敏的15种磺胺类药物的LC-MS/MS分析方法，并采用同位素标记的内标进行定量分析。对该方法的线性、灵敏度、准确度和精密度进行了研究，并将该方法成功地用于猪肉和鱼肉样品中15种磺胺类药物的检测。