小时候的愿望是——“能躺着绝不站着”。长大了才发现这也是大多数成年人的愿景。应验了“One World，One Dream”是当代最具普适性的价值观。相信人性中天然就存在着追求怎么省心怎么来的基因，这也使得我无可救药地对那些可以提高人们生活或工作中便利性的奇技淫巧十分好奇。近期《Analytical Chemistry》上发表的一篇名为：Integrated Process Analytical Platform for Automated Monitoring of Monoclonal Antibody N‑Linked Glycosylation，文中所展示的PAT技术应用实例，能够实现将2020版中国药典附录中所列：单抗N糖谱测定项目所需时间从接近40小时缩短至3小时左右。该实例指出该技术的应用将质检与生产的联合办公成为可能，也就是利用在线质检技术的快速检测特点，来辅助生产部门对工艺操作的调整方向，以期在质量稳定的前提下，实现工艺边界的经济效益最大化的成果。这也是在生产端应用PAT在线过程分析技术的初衷。

　　PAT技术能够提升工作效率的前提都来自于对老技术应用场景的拆解和深刻理解。按照还原论的思路来对整个流程进行拆解，探究每一个环节的优化可能和实现路径。该案列的思路也是如此，通过对抗体N-糖分析的全流程进行梳理来寻找突破口（见图1）。分析问题应该遵循：大处着眼，小处着手。从全局分析，制约抗体N糖分析效率的限速度的主要三步骤为：N-糖酶切（24h），样品冷冻干燥（8h）和荧光标记（4h）。这三个步骤消耗的时间占了整个流程所需时间的92%的时间。若能通过技术改进或者新方法的应用来达到提升效率，就可以凸现出PAT的现实意义。

　　N-糖酶切：药典中的对N-糖酶切的步骤的描述，又可以进一步分拆为样品前处理和酶处理两小环节。其中样品前处理采用了多次离心方法，该步骤大概会消耗接近1h。另在酶切环节，为保障酶切处理的完成度，方法中将时间规定高达24h。由于酶反应非常依赖反应体系的组成复杂度，如果样品处理后的背景越单一，酶反应就能以最快速完成，无需浪费时间。该篇文章也利用了这个改进思路。通过采用DIY的微量亲和层析柱进行样品前处理，不仅速度快，而且还使得样品纯度一步即达到较高纯度（见图2）。该方式简化了反应背景，让后续的N-糖酶切进行的更加顺利，该文章列出该方式下的N-糖酶切的实际时间为5min-1h，这与我们的药典方法相比就是数量级的提升(5min-1h这个时间跨度较大，主要原因推测为：部分抗体药物除了Fc上有N-糖，在Fab上也有N-糖)。另外也需要注意到，N-糖酶切的限速步骤不仅和反应背景的“干净”程度有关，还与样品的处理量有关，为使后续HPLC分析信号具有一定的信噪比，最开始的样品处理，就需要设置基准样品量。该案例是通过在线nm的信号来对取样量进行动态控制，无论titer水平是多少，每次取样都能保证达到100ug左右抗体药物进入到N-糖处理环节，这也间接同时保证了在5min-1h时间内N-糖苷酶的完成度。

　　图1 抗体N-糖 2020版药典分析流程及时间（A）；PAT试验流程重构图（B）

　　荧光标记：2020版药典中的荧光标记需要2-4h。该案列是通过从两方面入手来提升标记效率。药典中是采用2AB荧光衍生试剂在无水的体系下进行反应，而该文中介绍了作者发现的采用有水体系，并添加了2-甲基吡啶硼烷（2-Picoline Borane）作为还原剂来提升衍生效率（见图3）。文中采用的方法将衍生时间缩短至2h，并极大的提升了衍生效率。也带来了后续HPLC分析的信号响应。

　　图3 在有水地衍生体系下，添加2-Picoline Borane作为还原剂情况下2AB衍生效率到近25倍提升

　　样品富集及冷冻干燥：药典中对衍生步骤中已标记好的N-糖需要进行纯化和干燥。这一步非常的关键，因为接下来的步骤就会进入HPLC分析，需要将过量的荧光试剂去除和置换上样试剂。但无论是采用凝胶过滤，还是固相萃取都需要对样品进行冷冻干燥已备后续使用。冷冻干燥就是一个限速步骤。在文中作者描述了采用多孔石墨柱（PCG）来进行样品富集的方案，并出人意料的未采用干燥步骤，而是直接贯穿式进样，这就需要满足PCG洗脱液条件，刚好符合HPLC色谱柱的上样条件。这一流程改进，将样品富集和处理的时间缩短至数分钟。

　　自动化：我们可以设想一个场景。在生产车间中将样品取样封装并登写记录，然后经过不同等级的洁净区，通过样品传递窗再递交到QC人员手中。可能这时候刚好遇到午餐时间，抑或是下班时间。那么这个样品只能留到第二天在进行处理。这就是传统工作流程的现实场景。文中就是通过PAT技术，也就是通过自动化技术将以上这些分割的，孤岛式的流程有机的整合串联到一起，实现无缝衔接的同时，还通过上文中描述的优化方式来进一步提高效率。这也极大地缩短了QC时间（见图4）。

　　通读完整篇文章，有一种酣畅淋漓的感觉，这让我想起索尼这家科技巨头一直以来秉持的理念——让科技改变生活。这句Slogan其实应用在生物制药领域也是非常的恰当，单说CMC领域中的质检和生产，这两者是相辅相成，但碍于两部分的试验工具没有适合的衔接点，造成目前两者脱接的处境。PAT技术是最可能填补这个空缺的工具。从文中我们可以看到作者不仅借助了仪器制造商的方案：从在线无菌取样，样品在线定量反馈，在线样品前处理，再到python自动化程序的编写，还加入了DIY的亲和层析柱和创新的强化衍生的方案。这些都要求不同仪器供应商，甚至是制药界的从业者积极拓宽自己的知识面，成为复合型人才，我们的PAT技术才有可能梦想照进现实。目前PAT的应用还是多见于国外，希望未来有源源不断地应用在神州大地涌现，扎根发芽。

　　求学于分析化学，谋职在生物制品，热诚为行业分享，方向却不取一边，入行已有千日夜，内心仍此间少年，执笔希君多智选，还看设备面面观。